Гибридизация нуклеиновых кислот in situ Метод основан на. Флуоресцентная гибридизация in situ Флуоресцентная in situ гибридизация

08.03.2022

Возможности гибридизации in situ могут быть значительно повышены за счет одновременного использования нескольких флуоресцентных цветов. Многоцветная флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) в своем простейшем варианте может быть использована для маркировки (окрашивания) многих характеристик, поскольку в гибридизации применяются различные флуорофоры. При использовании не одних цветов, а их комбинаций, с помощью микроскопов с цифровой обработкой изображений в отдельных клетках можно одновременно обнаруживать гораздо больше выделенных красителями характеристик.

Рис. 1. Многоцветная FISH

Для подробного ознакомления с флуоресцентными микроскопами основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам.

На рисунке 1 представлен типичный образец многоцветной флуоресцентной гибридизации - FISH. Нормальные мужские лимфоциты были гибридизированы с FITC-биотином, окрашенным Chr2l и ChrY зондами, и CY3-дигоксигенином, окрашенным Chrl3 и ChrY зондами. Вверху слева - снимок ядер ДНК, окрашенных ДАПИ, полученный с помощью ДАПИ фильтра. Вверху справа - снимок Chr2l и ChrY, окрашенных FITC, полученный с помощью FITC-фильтра. Внизу слева - снимок Chrl3 и ChrY, окрашенныхCY3, полученный с помощью CY3 фильтра. Нижний правый снимок является комбинированным изображением, на котором в цвете представлены все хромосомы-мишени. Этот образец был предоставлен доктором Тимом Хоузилом, Интегрейтид генетикс, Фраминхэм, Массачусетс.

Техника многоцветной FISH, объединенная с методами цифровой обработки изображений, на сегодня предлагает не имеющие себе равных возможности неизотопного обнаружения множественных последовательностей нуклеиновых кислот для анализа компонентов клеток, хромосом и генов.

Флуоресценция - явление, при котором химическое соединение возбуждается на одной длине световой волны, а излучает на другой, обычно большей - применяется во всех биологических науках для изучения разнообразных структур и внутриклеточных процессов. Технологические успехи в разработке красителей и микроскопов привели за последнее десятилетие к быстрому развитию флуоресцентных методов.

В этой обзорной статье будут изложены основы FISH-метода, ограничения, с которыми столкнулись исследователи за годы применения FISH, последние разработки аппаратного и программного обеспечения, красителей и реагентов, повлиявшие на развитие этого метода, и текущие направления в этой области. Новейшие достижения этого метода, приведшие к его применению не только в исследовательских лабораториях, но в клинической диагностике, будут также рассмотрены в этой статье.

Обзор метода FISH

Применение FISH стремительно растет в геномике, цитогенетике, пренатальных исследованиях, биологии новообразований, радиоактивном маркировании, генном картировании, амплификации генов и основных биомедицинских исследованиях. В принципе, этот метод достаточно прост.

Гибридизацией идентифицируются, или помечаются, геномные последовательности-мишени, таким образом, что можно наблюдать их местоположение и размер. Последовательности ДНК или РНК из подходящих, в зависимости от хромосомы, зондов сначала помечаются репортерными группами, которые позже идентифицируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Помеченный ДНК или РНК зонд потом гибридизируется с метафазными хромосомами или покоящимися ядрами на предметном стекле. После промывания и усиления сигнала образец исследуется по репортерным группам с помощью флуоресцентной микроскопии.

FISH позволяет достигать очень высокого пространственного разрешения морфологических и геномных структур. Этот метод довольно быстрый, простой в осуществлении и характеризуется высокой стабильностью красителей. В зависимости от используемого зонда можно определить геном отдельной особи, целые хромосомы, участки хромосом и последовательности уникальных копий.

Прежние ограничения

До недавнего времени FISH была ограничена аппаратным и программным обеспечением, реагентами, технологией получения красителей и высокой стоимостью исполнения. Серийно выпускаемые аппаратные средства для микроскопов, оптимизированные для многоцветной FISH, были недоступны до середины 1990-х годов. До этого микроскопы приходилось специально настраивать для приложений FISH. Большинство микроскопической оптики не было предназначено для обнаружения световых сигналов низкого уровня, характерных для FISH. Поскольку при использовании этого метода существенно улучшилось разрешение геномов, возросли и требования к микроскопической оптике. Представляли проблему и хроматические аберрации на многих длинах волн. Для многоцветного анализа в особенности, все линзы, включая собирающую линзу, должны были иметь коррекцию хроматических аберраций. К тому же, очень трудно было настраивать эпифлуоресцентные источники света для получения равномерного освещения.

Анализ снимков многоцветной FISH требует разделения различных сигналов либо (а) отдельными фильтр-кубами, либо (b) использованием насадки светофильтров возбуждения с широкополосными дихроичными и пороговыми фильтрами. Развитие технологии фильтров исправило некоторые прежние проблемы, вызванные оптической несоосностью и разъюстировкой, вызываемых механическим переключением между отдельными фильтр-кубами. Сменные фильтры света возбуждения, применяемые с многополосными дихроичными и пороговыми фильтрами, могут эффективно работать с тремя цветами при использовании отдельных фильтров возбуждения для каждого цвета без регистрации сдвига. Но при работе более чем с тремя цветами все же надо использовать однополосные фильтры.

Для сбора данных использовались высокочувствительная цветная пленка или ПЗС (прибор с зарядовой связью), и в обоих случаях были проблемы с точностью цветопередачи. В дополнение, были проблемы с наложением изображений разных цветов, снятых с одного образца с применением различных красителей-зондов.

Программное обеспечение для количественного анализа образцов, приготовленных с помощью флуоресцентных реагентов, также оставляло желать лучшего, поскольку существующие системы анализа изображений не были оптимизированы для работы с флуоресцентными образцами выборки. Визуальный анализ является трудоемкой и часто субъективной процедурой, поэтому без использования передовых достижений флуоресцентной визуализации анализ флуоресцентных выборок был труден и допускал двоякое толкование. Исследователям обычно приходилось иметь в штате собственных программистов для разработки собственных программ для анализа изображений.

Самих реагентов и красителей было недостаточно для всех приложений. Например, эффективность определения места гибридизации падала с уменьшением размера зонда, что накладывало серьезные ограничения на те образцы, которые, можно наблюдать флуоресцентной микроскопией. Число различных флуоресцентных красителей было ограничено; к тому же они обладали невысокой фотостабильностью. Но развитие технологии флуоресцентных красителей и сопутствующих технологий в рамках федерально финансируемого Проекта «Геном человека» сейчас приносят свои плоды. Уже существуют зонды для всех хромосом человека, а также растет число доступных зондов генов. Наборы для гибридизации in situ и флуоресцентно-отмеченные зонды сегодня серийно выпускаются несколькими компаниями.

Цена была еще одним серьезным препятствием. Поскольку на рынке не было серийно выпускаемых FISH систем, исследователям приходилось собирать системы, получаемые под заказ, включая реагенты, зонды, микроскоп, аппаратное и программное обеспечение по обработке изображений, анализу данных и разработке отчетов. Проведение многоцветной FISH с комплексным анализом изображения могло стоить исследователю более $200 000 - сумма труднодоступная для большинства клинических исследователей. В результате, многие исследователи, желающие использовать FISH в своих лабораториях, не имели такой возможности.

FISH стала широко доступной

Многие производители аппаратного и программного обеспечения разработали доступные серийно выпускаемые системы, как альтернативу системам под заказ. Атмосфера сотрудничества, возникшая среди многих фирм и лабораторий, занимающихся FISH, привела к новым прорывам в этой области. И свои достижения авторы публикуемых работ рассматривают именно в рамках такого сотрудничества.

Рис. 2. Рабочий экран программы MultiFluor

Система, работающая в Соединенных Штатах и обеспечивающая средние цены для серийно выпускаемых для исследований FISH систем, объединяет компоненты многих производителей и полагается на последние достижения в программной обработке изображений, аппаратном обеспечении микроскопов и других аксессуаров. Для клинических исследовательских лабораторий эта система оказывается полезной во многих приложениях. Будучи интегрированной и автоматизированной, она позволяет проводить клинические испытания в полном объеме.

Система программного обеспечения, представленная здесь - MultiFluor ™ -многопараметрическая система визуализации (Системы исследования биологических структур), разработанная на базе Microsoft® Windows (корпорация Майкрософт, Беллевуе, Вашингтон) и предназначенная для обнаружения, анализа и представления структурных и молекулярных характеристик, полученных по выборкам многоцветной FISH. Время анализа и точность результатов улучшены благодаря соотнесению многих характеристик на различных длинах волн в каждой выборке. Эта система облегчает получение изображения, его хранение, управление базой данных, автоматическое управление микроскопом и полнофункциональный графический анализ данных.

На рисунке 2 изображен экран с обзорным представлением данных программы MultiFluor. Пользователи могут просмотреть снимки и соответствующие им данные, сопоставить многопараметрические данные, полученные в разных цветах (на разных длинах волн) с помощью различных инструментов графического построения, включая гистограммы, диаграммы рассеяния и т. д. Здесь различные графики показаны вместе с набором многоцветных снимков клетки (изображающих ДАПИ-ядра, FITC-ChrX, CY3-ChrY и CY5-Chr2l), наряду с исходными данными, представленными в таблице.

Исследователи FISH имеют возможность автоматически получать снимки на разных длинах волн в разных фокальных плоскостях, визуализировать зонды многоцветной FISH, снабжать снимки примечаниями и распечатывать их, хранить и извлекать большие объемы данных наборов многоцветных изображений. Метафазные хромосомы многоцветной FISH могут быть проанализированы генным картированием, с помощью сравнительной геномной гибридизации (СГГ), а также генерацией кариотипов. Выбранные пользователем области образца могут быть просканированы и проанализированы. Программа автоматически фокусирует систему, получает снимки на многих длинах волн, запоминает положение клеток на предметном стекле, измеряет различные характеристики, включая подсчет зонда, интенсивность флуоресценции и морфометрию клетки. Различные характеристики на различных длинах волн могут быть соотнесены друг с другом.

Дополнительной характеристикой системы является возможность ее работы с персональными компьютерами (ПК), объединенными в сеть. В типичной конфигурации один компьютер является онлайновой станцией, соединенной с аппаратным обеспечением камеры и микроскопа. Этот компьютер управляет получением снимков и производит мгновенный анализ. Другие ПК являются вторичными станциями анализа информации, где обрабатываются данные, поступившие с первого ПК, или где автономно выполняется какой-либо специальный анализ.

Программа позволяет представить все компоненты в ярких псевдоцветах для одновременной многоцветной визуализации. Например, одновременные снимки четырехцветного эксперимента (с использованием ДАПИ (синий), FITC (зеленый), CY3 (красный), и комбинации FITC- CY3 (желтый)) могут быть представлены отдельно или быть объединены в одно изображение (как показано на рисунке 1). Каждый снимок может быть интерактивно усилен для выделения интересующих характеристик. С помощью программы легко создавать гистограммы, диаграммы рассеяния, таблицы, линейные графики и другие формы представления и оценки данных (рисунок 2). К тому же данные хранятся в легко доступных и популярных форматах, таких как TIFF, JPEG, GIF и других.

Онкологические, пренатальные и биологические исследования

Описываемые FISH системы разработаны для обеспечения большей доступности исследователям, чем прежние, изготавливаемые под заказ. Они все больше применяются в онкологии, изучении патологий, цитогенетике и биологии развития. Среди их приложений такие, как анализ интерфазных клеток по количеству пятен при наблюдении с многоцветными красителями, иммунофенотипирование, морфометрия клетки и состав ДНК.

С помощью этих систем проводится анализ отклонений в числе копий хромосом, соотнесенных с общим составом ДНК, которые связаны с образованием опухолей мочевого пузыря. В пренатальных исследованиях эти системы могут использоваться для обнаружения анеуплоидий в покоящихся ядрах, связанных с пренатальными дефектами, включая синдром Дауна, синдром Тернера, синдром Клайнфельтера и другими. В клеточной биологии и биологии развития эта система может использоваться для картирования маркеров поверхности клетки и их относительного распределения, таких как рецепторы, маркеров цитоплазмы, включая белки цитоскелета, информационные РНК и специфические гены.

Диагностический потенциал

За последние полтора десятилетия стало понятно, что FISH метод имеет чрезвычайно большой потенциал не только как инструмент в исследовательской работе, но и в клинической диагностике в таких областях, как пренатальная диагностика, цитогенетика и развитие опухолей. Отсутствие высококачественных, доступных по цене систем, не только тормозило распространение FISH среди исследователей, но делало этот метод недостижимым для диагностических центров многих медицинских учреждений

Результаты, которые раньше могли быть получены лишь с помощью дорогостоящего, изготовленного под заказ оборудования, сейчас могут быть получены с помощью этой системы - и это является одним из наиболее важных ее достоинств. Мечта применить FISH не только для более широкого круга биомедицинских исследований, но и прямо поставить ее на службу пациентам, возможно, станет реальностью в не столь отдаленном будущем.

Флуоресцентная стереомикроскопия

Эпифлуоресцентное освещение

До недавнего времени, флуоресцентное освещение было доступно лишь на исследовательских микроскопах, оборудованных специальными светосильными объективами. Необходимость стереомикроскопии в этой методике усилилась с появлением генетически кодированных и биологически специфичных флуоресцентных белков, таких как GFP (зеленый флуоресцентный белок).

Рис. 1. Стереомикроскоп с эпифлуоресцентным осветителем

Применение стереомикроскопов для наблюдения GFP настолько распространено, что стерео флуоресцентные осветители чаще называются GFP-осветителями, несмотря на то, что они могут использоваться во многих других приложениях, как в биологических науках, так и в электронной промышленности. Большие образцы, такие как личинки, нематоды, полосатый данио, ооциты и зрелые насекомые легко наблюдать (и ими легко манипулировать), если они окрашены GFP и освещаются светом флуоресценции. Флуоресцентное освещение выявляет, какие организмы производят флуоресцентный белок, а стереоскопический способ наблюдения, в сочетании с большим полем зрения и большим рабочим расстоянием, позволяет наблюдателю пользоваться во время эксперимента пинцетом, пипетками или микроманипуляторами. Другие, более типичные образцы, также легко исследовать с помощью стереомикроскопов с флуоресцентным освещением.

Осветитель для эпифлуоресценции на стереомикроскопе функционирует подобно тем, которые установлены на более сложных микроскопах. Обычно, флуоресцентный осветитель представляет собой ксеноновую или ртутную дуговую лампу, помещенную во внешний блок осветителя, который соединяется микроскопом через промежуточный тубус (или вертикальный осветитель, см. рисунок 1 и 2), расположенный между трансфокатором микроскопа и окулярными тубусами. На сегодняшний день этот тип освещения ограничен приложениями, в которых применяются стереомикроскопы с общим главным объективом (CMO), поскольку для настройки стереомикроскопа Грену или другого стереомикроскопа, основанного на схеме сведения лучей, под свет флуоресценции невозможно использование серийно выпускаемых деталей.

Свет, излучаемый дуговой лампой, направляется через настраиваемую собирающую линзу-коллектор на возбуждающий фильтр, находящийся в комбинированном блоке светофильтров (как показано на рисунках 2 и 3). Этот фильтр пропускает свет лишь в определенном волновом диапазоне (полосе пропускания). Свет, прошедший через фильтр, отклоняется затем по оптическому пути микроскопа в его нижнюю часть (модуль трансфокатора и объектив в стереомикроскопе) и направляется на образец дихроичным зеркалом, которое, в зависимости от настройки, отражает, селективно-фильтрует и/или пропускает свет определенных длин волн/областей спектра. Термин дихроичное (или дихроматическое) отображает свойство фильтра или зеркала «различать» цвета падающего света, отражая свет того цвета, который оказывается ниже заданного предела длин волн, и, пропуская цвета выше этого предела.

Рис. 2. Ход лучей во флуоресцентном стереомикроскопе

Сфокусированный пучок света возбуждения проходит через трансфокатор и объектив, где образует перевернутый световой конус, облучающий образец, вызывающий возбуждение всех флуорофоров в образце, полоса поглощения которых соответствует полосе пропускания облучающего света. Вторичное флуоресцентное свечение (с длиной волны обычно большей возбуждающего света), испускаемое из образца, захватывается общим главным объективом стереомикроскопа и направляется обратно через трансфокатор к пороговому фильтру, который блокирует свет на длине волны возбуждения и пропускает лишь свет с длиной волны испускания. Тубус микроскопа на рисунках 1 и 2 сконструирован таким образом, что более длинные волны флуоресцентного испускания, проходя обратно, через левый и правый оптические каналы трансфокатора, фокусируются независимо перед тем, как они достигнут эпифлуоресцентного осветителя. Свет из левого канала проходит прямо к пороговому фильтру, после которого направляется в окулярные тубусы или в фотопорт. Напротив, свет в правом канале сначала направляется обратно через дихроичное зеркало, а потом к пороговому фильтру и окулярам. Этот свет не имеет выхода в порт камеры и может быть использован только для наблюдения образца.

Детали конструкции флуоресцентного комбинированного блока фильтров представлены на рисунках 2 и 3. Каждый блок содержит однополосный фильтр света возбуждения, два пороговых фильтра и дихроичное зеркало. Свет ртутной дуговой лампы попадает в блок светофильтров через возбуждающий фильтр, и отражается от поверхности дихроичного зеркала, как говорилось выше, и как показано на рисунке 3. Вторичное флуоресцентное излучение проходит через пороговые фильтры. Возбуждающий фильтр, дихроичное зеркало и пороговый фильтр левого канала вклеены в систему, а пороговый фильтр правого канала закреплен в небольшой рамке, которая может быть удалена из блока, если ослабить ее крепежные винты. Сняв пороговый фильтр, можно получить доступ к дихроичному зеркалу, расположенному внутри блока фильтров. При установке сменных фильтров, следите за тем, чтобы клей не попал на поверхность фильтров, и перед тем, как брать фильтры и дихроичное зеркало, обязательно надевайте перчатки, чтобы не испачкать поверхность отпечатками пальцев.

Флуоресцентный вертикальный осветитель может вместить три блока светофильтров и пустой блок диа-фильтров (без фильтров) для обычного наблюдения по методу светлого поля. Блоки фильтров крепятся на направляющих и устанавливаются в оптический путь с помощью рукоятки, используемой для контроля положения направляющих. К каждому блоку прилагается соответствующая идентификационная табличка-пластина. Таблички вставляются в щелевое отверстие в корпусе осветителя в последовательном порядке, чтобы оператор мог легко выбрать нужный блок фильтров для флуоресцентного наблюдения.

Рис. 3. Комбинации фильтров флуоресценции в стереомикроскопе

Набор комбинаций фильтров, представленный в таблице 1. Эти фильтры охватывают широкий диапазон флуоресцентного возбуждения и испускания и должны быть полезны во многих биологических исследованиях, где применяются обычные флуоресцентные красители. Эти комбинации фильтров также подходят для промышленного использования, как например, для анализа полупроводниковых пластин с ИС на загрязнение флуоресцентными полимерами фоторезистов. С помощью подбора соответствующей комбинации фильтров возбуждения/испускания, могут использоваться флуоресцентные зонды с длинами волн возбуждения в диапазоне от 380 до 510 нанометров (см. таблицу 1). Эти комбинации фильтров также весьма полезны в исследованиях с различными мутантами зеленых флуоресцентных белков, включая их голубую и синюю разновидность.

В культурах живых клеток с флуоресцентными метками белков, интенсивность сигнала может быть значительно повышена, если комбинации фильтров точно соответствуют профилю возбуждения и испускания флуорофоров. Например, в случае DS-красных сигналов, визуальное наблюдение и регистрация изображения красной флуоресценции фотоприемниками могут быть значительно улучшены за счет смещения красного сигнала в сторону эмиссии более оранжевого света. В дополнение, комбинации фильтров, подобранные для исследований образцов растений, с интенсивной фоновой автофлуоресценцией хлорофилла, часто бывают более эффективны при точном подборе соответствующих спецификаций фильтра и эмиссионного сигнала. Многие из этих критериев учитываются инженерами-разработчиками микроскопов для оптимизации полосы пропускания различных комбинаций фильтров стереомикроскопов.

Табл. 1. Комбинации флуоресцентных фильтров стереомикроскопов

Комплект фильтров	Диапазон длин волн возбуждения	Дихроичное зеркало	Диапазон длин волн испускания
Синий GFP/DAPI
Голубой (EGFP) GFP
Полоса пропускания GFP
Расширенная полоса пропускания GFP
TRITC (Ds-красный)
Полоса пропускания желтого GFP

Как и все чувствительные интерференционные фильтры, фильтры комбинированного блока со временем выходят из строя из-за интенсивного светового и ультрафиолетового облучения. Такие характеристики, как полоса пропускания и коэффициент пропускания, также меняются при использовании и хранении фильтров в среде с повышенной влажностью. Для увеличения срока службы такие фильтры следует хранить в сушильном шкафу или герметично закрытом контейнере с влагопоглотителем. Если наблюдения не проводятся, затвор осветителя следует держать закрытым, чтобы уменьшить количество света, проходящее через фильтры. Чистку фильтра можно производить только сухим воздухом из баллончика, мягкой щеткой из верблюжьей шерсти или безмасляным газом из газового баллона. Во избежание царапин и потертостей, никогда не протирайте фильтры с мягким интерференционным покрытием фильтров, тканью для протирки линз.

Фокусировка и юстировка дуговых ламп

Приобретите практический опыт юстировки и фокусировки дуговых ламп с помощью данного обучающего интерактивного приложения Mercury or Xenon Burner, в котором смоделированы все процессы юстировки лампы во флуоресцентном микроскопе.

С помощью стереомикроскопов можно наблюдать различные образцы в свете флуоресценции. Благодаря увеличению объектива от 0,5х до 1,6х и диапазону трансфокации до 15х, эти стереомикроскопы могут обеспечить общее увеличение системы от 4х до 540х, что сравнимо с диапазоном наблюдения классических сложных микроскопов. Широкий диапазон увеличения позволяет микроскопистам наблюдать как большие живые образцы, так и мелкие детали в тонких срезах, окрашенных флуорохромами, помещенных на предметном стекле. Пример наблюдения в свете флуоресценции с высоким коэффициентом увеличения приведен на рисунке 4. На нем представлен окрашенный тремя метками толстый образец почки мыши. Образец был окрашен ДАПИ, Alexa Fluor 488 WGA и Alexa Fluor 568 (использовались зонды Alexa Fluor и образец компании Molecular Probes и наблюдался с использованием трех комбинаций фильтров из таблицы 1: Blue GFP/DAPI, Endow GFP Bandpass, TRITC DsRed. Это изображение отчетливо демонстрирует возможности флуоресцентной стереомикроскопии на больших увеличениях при наблюдении образцов, приготовленных для сложных микроскопов.

Рис. 4. Срез почки мыши в свете флуоресценции

Другие производители стереомикроскопов предлагают альтернативные способы освещения для флуоресцентного возбуждения и наблюдения. В наиболее популярной конфигурации, представленной на рисунке 5, для флуоресцентного возбуждения используется внешняя схема, не использующая оптическую систему микроскопа для визуализации изображений. Свет из блока осветителя, сначала проходит через возбуждающий фильтр, и затем направляя через тубус, расположенный сзади корпуса микроскопа. В нижней части тубуса расположена система линз, направляющих свет возбуждения на образец. В такой конфигурации свет направляется прямо на образец при любом увеличении трансфокатора, обеспечивая тем самым одинаковую интенсивность флуоресцентного освещения и равномерный темный фон при любом значении увеличения.

Вторичное флуоресцентное излучение, испускаемое окрашенным образцом, захватывается общим главным объективом (рисунок 5) и проходит по каналам блока трансфокатора к пороговым фильтрам в верхней части микроскопа. После этого свет направляется либо к окулярам для прямого наблюдения, либо в тубус камеры для получения цифрового изображения или микрофотографирования. В этой конфигурации не нужны дихроичные зеркала, и это ее главное преимущество, другое преимущество - независимость от предварительно собранных блоков фильтров, что дает исследователю большую свободу выбора фильтров. Тем не менее, эта конфигурация может привести к ошибкам в работе неопытных операторов, вызванным неверным подбором комбинации фильтров.

Рис. 5. Микроскоп с отдельным ходом лучей света возбуждения

Интенсивное ультрафиолетовое излучение ртутной дуговой лампы, используемой в качестве источника света возбуждения во флуоресцентной микроскопии, может нанести серьезные повреждения сетчатки глаза. Во избежание этого, на корпусе микроскопов многих производителей есть защитные устройства, которые отфильтровывают ультрафиолетовый свет, облучающий образец на предметном столике. Другие меры предосторожности включают ультрафиолетовые пороговые фильтры на пути наблюдения и защиту от рассеянного света вокруг блока осветителя. В направляющие и поворотные рамки флуоресцентных интерференционных фильтров, если они не используются, часто вставляются специальные заглушки в форме фильтров.

Флуоресцентные стереомикроскопы часто оборудованы специальной диафрагмой, расположенной где-нибудь между блоком ртутного осветителя и вертикальным осветителем, для блокировки опасного ультрафиолетового излучения, исходящего от лампы, в то время, когда образец не наблюдается. Когда наблюдения не проводятся, эту диафрагму необходимо устанавливать на пути прохождения света.

При наблюдении образцов светосильными апохроматическими объективами (от 1.6x до 2.0x) во флуоресцентной стереомикроскопии, в нижних участках поля зрения могут возникать отблески, или горячие пятна. Этот артефакт обычно проявляется только при низких коэффициентах трансфокации, и исчезает с на больших увеличениях. В большинстве случаев отражения не возникают, если увеличение объектива мало (от 0,5х до 1,0х), независимо от оптической коррекции, и этот эффект обычно отсутствует у объективов с высокой числовой апертурой и низкой коррекцией (ахроматы или планахроматы).

Как показано в таблице 2, во флуоресцентной микроскопии существует много приложений, где применяются стереомикроскопы. Количество образцов, которые удобно наблюдать именно в этом режиме, весьма велико, и относятся они к широкому кругу дисциплин от биологии до промышленных производств.

Табл. 2. Приложения флуоресцентной стереомикроскопии

Область	Приложения - Анализ
Биология	Экспрессия генов, сортировка клеток, диссекция, процессы развития, исследования глаз и мускулов
Ботаника
Фармакология	Капиллярный поток, лекарства, природоохранные наблюдения
Гидрология	Качество воды, клеточные структуры и анализ мембран фильтров
Агрономия	Изучение семян, экспрессия генов и трансгенетика
Электроника	Паяльная паста, анализ эпоксидных смол, проверка покрытий, отбор полимеров для интегральных микросхем
Полупроводники	Загрязнение фоторезистами, наличие инородных частиц, производственный контроль
Полимеры	Наличие инородных частиц, пустот, гранул, неполимеризированных областей
Металлообработка	Трещины, поверхностные дефекты, загрязнения, сварка, анализ разрушений
Материалы	Трещины, сварка, карбоновые соединения, исследование ориентаций
Бумажное производство	Волокна, покрытия и включения
Судебная экспертиза	Текстильные волокна, жидкости организма, отпечатки пальцев, банкноты, подделки

Флуоресцентная стереомикроскопия обладает уникальным, в сравнении с классическим сложным микроскопом, свойством трехмерного наблюдения. В дополнение к этому, стереомикроскопы обладают большими рабочими расстояниями и глубиной поля, что обеспечивает более широкое панорамное поле зрения и более интенсивную флуоресценцию. Эти характеристики имеют огромное значение для исследователей, которым приходится работать с большими биологическими образцами и материалами, и для специалистов, ведущих подготовительную работу, как например, монтаж компонентов, производственный контроль электроники или резка. Поскольку для специальных приложений становятся доступными все более точные комбинации фильтров, применение флуоресценции в стереомикроскопии продолжает расти.

Традиционная цитогенетика при изучении кариотипа всегда была ограничена бэндовым уровнем разрешения. Даже при использовании высокоразрешающих методов дифференциального окрашивания хромосом мы всего лишь выявляли большее количество бэндов на хромосоме, но не были уверены, что добираемся до молекулярного уровня разрешения. Последние достижения ДНК-технологий и цитогенетики сделали возможным использование методов FISH для анализа изменений хромосомной ДНК на молекулярном уровне. Молекулярная цитогенетика обеспечила революционный прорыв в цитогенетике, позволив:

Осуществлять анализ структуры ДНК хромосом в диапазоне 10-100 килобаз;
проводить диагностику неделящихся интерфазных клеток, что оказало огромное влияние на пренатальную диагностику и преимплантационную генетическую диагностику (ПГД).

Технология FISH использует ДНК-зонд, который связывается или ренатурирует специфические последовательности ДНК внутри хромосомы. Денатурированный зонд инкубируется с нативной ДНК клетки, также денатурированной до одноцепочечного состояния. Зонд замещает биотин-дезоксиуридинтрифосфат или дигоксигенин-уридинтрифосфат на тимидин. После ренатурации зондом нативной ДНК комплекс «зонд-ДНК» можно обнаружить при добавлении меченного флюорохромом авидина, связывающегося с биотином, или меченного флюорохромом антидигоксигенина. Дополнительное усиление сигнала можно получить, добавив антиавидин и изучив получившийся комплекс с помощью флюоресцентной микроскопии. Пометив несколькими различными флюорохромами разные ДНК-зонды, можно одновременно визуализировать несколько хромосом или хромосомных сегментов внутри одной клетки в виде разноцветных сигналов.

Возможность определения специфических генных сегментов , имеющихся или отсутствующих на хромосомах, позволила диагностировать синдромы генных последовательностей на уровне ДНК, как, впрочем, и транслокации в интерфазных ядрах, зачастую - в отдельных клетках.

Материалом для FISH могут служить или метафазные хромосомы, полученные из делящихся клеток, или интерфазные ядра из клеток, не находящихся в стадии деления. Срезы предварительно обрабатывают РНКазой и протеиназой для удаления РНК, которая может вступать в перекрестную гибридизацию с зондом и хроматином. Затем их нагревают в формамиде, чтобы денатурировать ДНК, и фиксируют ледяным спиртом. Затем зонд подготавливают к гибридизации путем нагревания. После этого зонд и хромосомный препарат смешивают и герметизируют покровным стеклом при 37 °С для гибридизации. Изменяя температуру инкубации или солевой состав раствора для гибридизации, можно повысить специфичность связывания и уменьшить фоновую маркировку.

Применение флюоресцентной гибридизации in situ - технологии FISH

Эффективность технологии FISH впервые была продемонстрирована при локализации генов на . С внедрением метода флюоресцентного мечения, гибридизация in situ оказалась незаменимой для диагностики хромосомных аномалий, не выявляемых традиционными методами бэндинга. FISH также сыграла ключевую роль в совершении одного из самых необычных открытий современной генетики - геномного импринтинга.

Свое развитие технология FISH получила в трех формах. Центромерные, или альфа-сателлитные, зонды характеризуются относительной хромосомной специфичностью, их использовали чаще всего в генетике интерфазных клеток. Эти зонды генерируют в некоторой степени диффузные сигналы адекватной силы в области центромеры, но не вступают в перекрестную гибридизацию с хромосомами, имеющими аналогичные центромерные последовательности. В настоящее время разработаны однокопийные зонды, дающие дискретный сигнал от специфического бэнда хромосомы и позволяющие избежать феномена перекрестной гибридизации. Эти зонды также можно использовать для определения копийности и специфичных регионов хромосомы, предположительно связанных с тем или иным синдромом. Однокопийные и центромерные зонды, разработанные для хромосом 13, 18, 21, X и Y, используют для пренатальной диагностики.

Возможно также «окрашивание» целых хромосом с помощью FISH . Благодаря технологии спектрального кариотипирования, при которой используют смесь различных флюорохромов, теперь стало возможным создание уникального флюоресцентного паттерна для каждой отдельной хромосомы с 24 отдельными цветами. Эта технология позволяет определять сложные хромосомные перестройки, не видимые при использовании традиционных цитогенетических методик.

Метод FISH в пренатальной диагностике. Для женщин старшего репродуктивного возраста беременность может оказаться поводом не столько для радости, сколько для беспокойства. С возрастом женщины связан риск развития хромосомных аномалий плода. Амниоцентез, осуществляемый на 16-й неделе беременности, с последующим анализом кариотипа занимает 10-14 дней. Использование FISH в предварительном обследовании позволяет ускорить диагностику и уменьшить время ожидания. Большинство генетиков и лабораторий придерживаются мнения, что метод FISH не следует использовать изолированно для принятия решения о дальнейшем ведении беременности. Метод FISH обязательно следует дополнять кариотипическим анализом, и его результаты как минимум должны коррелировать с патологической картиной ультразвукового исследования (УЗИ) или биохимического скрининга по крови матери.

Синдромы генных последовательностей известны также под названием синдромов микроделеции, или сегментарной анеусомии. Это делеции смежных фрагментов хромосомы, вовлекающие, как правило, многие гены. Синдромы генных последовательностей были впервые описаны в 1986 г. с использованием классических методик цитогенетики. Теперь, благодаря FISH, возможна идентификация субмикроскопических делеции на уровне ДНК, что позволило выявлять наименьший делецированный регион, связанный с развитием того или иного синдрома, получивший название критического региона. После определения критического региона для синдрома зачастую становится возможным идентифицировать специфические гены, отсутствие которых признают ассоциированным с этим синдромом. В недавно вышедшем руководстве по синдромам генных последовательностей сообщают о 18 синдромах делеции и микроделеции, ассоциированных с 14 хромосомами. Некоторые наиболее часто встречающиеся синдромы генных последовательностей и их клинические проявления приведены в табл. 5-2.

Теломеры - образования, прикрывающие с концов длинные и короткие плечи хромосом. Они состоят из повторяющихся последовательностей TTAGGG и предотвращают слияние концевых участков хромосом между собой. Теломерные зонды играют важную роль в распознавании комплексных транслокаций, которые невозможно определить традиционными цитогенетическими методами. Кроме того, одним из открытий Проекта «Геном человека» был тот факт, что регионы хромосом, прилежащие к теломерам, богаты генами. В настоящее время показано, что субмикроскопические субтеломерные делеции ответственны за возникновение многих генетически обусловленных заболеваний.

Гибридизация нуклеиновых кислот in situ Метод основан на возможности образования двуцепочечных гибридов между искусственно создаваемых на основе одноцепочечных последовательностей (рибо- или дезоксирибо-, олиго- или полинуклеотидных) мечеными зондами и комплементарными им последовательностям в мишенях – анализируемых молекулах ДНК или РНК. Для выявления участков гибридизации ДНК-пробу (ДНК-зонд) метят какой-либо репортерной группой: ü радиоактивным изотопом, ü флуорохромом, ü ферментом, дающим окрашивание или люминесцирующий продукт, ü гаптеном, с которым связывается меченое тело и т. д.

Выявляя гибрид благодаря наличию в зонде репортерной группы можно - оценить число генов, кодирующих определенный вид РНК, - определить долю нетранскрибируемой ДНК в геноме, - установить сцепление определенных генов с другом друг - и их точное расположение на хромосомах. Метод молекулярной гибридизации обладает высокой чувствительностью (можно выявить малое количество меченого зонда (10 -15 и 10 -19 М) и соответственно комплементарной ему последовательности в мишени) и быстротой анализа, что позволяет использовать этот метод как для исследовательской деятельность так и для диагностики наследственных и инфекционных заболеваний в медицине, ветеринарии и растениеводстве.

Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, основанных преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики

Интерфазная цитогенетика: 1. Многоцветный бэндинг хромосом (МВС). 2. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). 3. Комбинация FISH с другими методами: -цитология + FISH; -гистология + FISH; -имунофенотипирование + FISH (FICTION); Метафазная цитогенетика: 1. Сплошное окрашивание хромосом (Whole painting). 2. Сравнительная геномная гибридизация (CGH). 3. Кариотипирование с переменой цвета (ССК). 4. Многоцветное кариотипирование: cпекральное кариотипирование (SKY); многоцветная FISH (M - FISH, M - BAND).

FISH – fluorescence in situ hybridization – цитогенетический метод, используемый для детекции и локализации специфических последовательностей ДНК на хромосомах, м. РНК и др. В основе методики лежит гибридизация флуоресцентно меченого ДНК/РНК зонда с комплементарной последовательностью ДНК/РНК. Выявление метки происходит с помощью флуоресцентного микроскопа. Метод FISH был введен более 30 лет назад. Он широко распространился как метод физического картирования генов на хромосомах. Позднее он стал применяться в других областях исследований (в областях клинической генетики, репродуктивной медицины, токсикологии, эволюционной биологии, сравнительной и клеточной геномики и хромосомной биологии). На данный момент FISH преимущественно используется для построения физических и генетических карт хромосом, для выявления структурных перестроек, транслокаций, микроделеций, генных амплификаций в интерфазных и метафазных хромосомах. В результате развития науки (лучшего понимания химических и физических свойств нуклеиновых кислот и хроматина), а также развития флуоресцентной микроскопии и цифровой визуализации, метод постоянно совершенствовался (произведено улучшение чувствительности, специфичности, разрешения), и было разработано много вариаций данного метода.

1) Cells are dropped on to a glass slide causing chromosomes to spread 4) Chromosomes are counter stained using DAPI 2) Fluorescently labeled probe is placed on chromosomes and sealed. 3) The probe and chromosomes are denatured, hybridised then washed 5) Slide is viewed under a fluorescent microscope

Общий вид протокола для постановки FISH можно представит следующем виде: 1. Подготовка гистологического или цитологического препарата. Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток. 2. Предварительная обработка (если необходимо). Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию. 3. Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация. Для того, чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85 -900 С.

4. Гибридизация. После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (370 С в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры. 5. Промывка. После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC). 6. Контр-окрашивание. При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4, 6 -диамидин-2 фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК. 7. Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа Выполнение рутинных операций (депарафинизация, предварительная обработка, промывка) может быть автоматизировано.

Исследование теломерных участков при помощи флуоресцентного микроскопа. Совмещены изображения, полученные на стадии интерфазы (ядро) и метафазы (отдельные хромосомы). синяя окраска - DAPI.

Преимущества FISH – метода: 1. возможность исследования генетического материала в интерфазных ядрах; 2. получение объективных результатов по принципу “да/нет" - это количественный метод; 3. относительно простая интерпретация результатов; высокая разрешающая способность. Недостатки FISH - метода: 1. флуоресцентные красители быстро "выцветают"; 2. для анализа результатов необходимы высококачественный флуоресцентный микроскоп.

В основе метода FISH лежит реакция гибридизации между созданным по специальным технологиям ДНК - зондом представляющим собой нуклеотидную, последовательность ограниченного размера, и комплементарным ему участком ядерной ДНК исследуемого цитогенетического препарата. ДНК–зонд- главный элемент для постановки FISH несет "метку", т. е. содержит нуклеотиды, напрямую связанные с флуорохромом или с гаптеном для дальнейшей визуализации антителами, несущими флуорохром. Несвязанная меченая ДНК отмывается, а затем проводится детекция гибридизованного ДНК-зонда с использованием флуоресцентного микроскопа.

Мечение ДНК делят на прямое и непрямое. Прямое мечение введение в ДНК репортерных элементов – – флуорохромов (родамина, диэтиламинокумарина, техасского красного и др.). Непрямой метод мечения - ДНК-пробу предварительно конъюгируют с промежуточными лигандами (биотином, диоксигенином, 2, 4 -динитрофенолом), присутствие которых на цитологическом препарате выявляется затем с помощью флуорохромов. В этом случае чувствительность метода намного возрастает, так как лиганд может содержать несколько сайтов взаимодействия с флуорохромом. Впервые in situ гибридизация с 32 Р-меченным зондом была описана в 1969 году. Разработка нерадиоактивных систем мечения и детекции ДНК зондов сделала метод in situ гибридизации безопасным, простым в исполнении и менее трудоемким при обработке результатов. Флуоресцентные красители являются мягкими и простыми в употреблении, могут храниться неопределенно долго, дают высокое разрешение, и позволяют одновременно исследовать несколько последовательностей ДНК.

Зонды: одноцепочечные/двуцепочечные ДНК/РНК первично/вторично меченые зонды. Зонды метятся: 1) напрямую: путем вставки нуклетидов, к которым прикреплен флюорохром (ПЦР или nick translation) 2) через репортерную молекулу (пр: digoxigenin, biotin) к которой крепятся флюоресцентно меченые антитела. Для усиления сигнала можно использовать вторичные, третичные и т. д. антитела, меченые флюоресцентной меткой. DNase nicks DNA Nick Translation DNA polymerase I adds new nucleotides to the 3’ hydroxyl DNA polymerase I removes individual bases from the 5’ end Визуализация хромосом: c помощью DAPI (2 mg/ml). 4’, 6 -diamidino-2 -phenylindole; сильное связывание с A-T богатыми участками ДНК; возбуждение UV светом; эмиссия 461 nm (blue).

В настоящее время можно выделить несколько основных подходов, широко используемых современной молекулярной цитогенетикой: Идентификация материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом. Детекция в интересующем районе конкретной последовательности ДНК. Анализ нарушения баланса отдельных хромосомных районов. Для идентификации материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом широко используются хромосом специфичные и район-специфичные ДНК-зонды (“painting probes”).

Характеристика зондов различных типов 1. локус-специфичные зонды(LSI - locus - specific identifiers, связывающиеся с определенными участками хромосом.) Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой (неповторяющимися) последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом. Они предназначены для выявления диагностически и прогностически значимых хромосомных аберраций при различных патологических состояниях (моносомии и трисомии по отдельным хромосомам). Наиболее широкое распространение этих проб получено в пренатальной цитогенетической диагностике, особенно в исследованиях клеток хориальной ткани, интерфазных ядер амниоцитов.

2. ДНК - пробы к теломерным участкам хромосом (TEL telomericprobe) предназначены для выявления делеций и перестроек, затрагивающих концевые участки плеч хромосом. Такие зонды специфичны для р- или q- плеч хромосом и комплементарны участку длиной около 300 т. п. н. от конца хромосомы. Как правило, ДНК - зонды для коротких и длинных плеч хромосом связаны с разными флуорохромами, что позволяет выявлять на одном цитогенетическом препарате оба теломерных участка хромосомы.

3. центромерные зонды-повторы, альфоидные или хромосомные нуменаторы (CEP – centromere. Enumeration. Probe) это хромосомо-специфические ДНК-пробы, представленные последовательностями тандемных альфа- и бета-сателлитных повторов. Эти повторы располагаются преимущественно в центромерных или прицентромерных гетерохроматиновых участках хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа, 4. зонды на всю хромосому, цельно-хромосомный зонд (WCP– Whole-Chromosome-Painting являются набором) небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Области применения FISH широко используется для решения следующих клиникодиагностических задач: 1. Перимплантационная пренатальная и диагностика хромосомны аномалий. Используется в клиниках экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и перинатальных центрах. Позволяет своевременно (до имплантации эмбриона в случае ЭКО или на ранних стадиях развития плода) выявить генетические нарушения у будущего ребенка и принять необходимые меры. 2. Онкогематология. Онкогематологические заболевания возникают в результате различных хромосомных аббераций, поэтому для их диагностики используют соответствующие CEP и LSI зонды. 3. Диагностика солидных опухолей. В настоящее время устанавливается все больше причинноследственных связей между развитием конкретных онкологических заболеваний и специфичных для них изменений в геноме. Поэтому при использовании соответствующих ДНКзондов можно проводить онкологическую FISH-диагностику.

Интерфазнаяцитогенетика: Комбинация FISH с другими методами: -имунофенотипирование FISH (FICTION); + FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and Interfase Cytogenetics as a Tool for Investigation Of Neoplasms) – для исследования опухолевых клеток. Для этого анализа используют неокрашенные мазки крови, костного мозга или препараты других тканей. 1 этап - препараты инкубируют со специфическими моноклональными антителами, 2 этап - проводят конъюгацию с флуорофорами для последующей визуализации комплекса антиген-моноклональное антитело. 3 этап - осуществляют гибридизацию in situ с ДНК-зондами. Для выявления моноклональных антител и ДНК-зондов используют флуорофоры, различающиеся по цвету. Изучение препарата под флуоресцентным микроскопом при наличии необходимого набора фильтров позволяет одновременно проводить анализ иммунофенотипа гибридизационных и сигналов в интерфазных ядрах.

Chromosomaldeletionof TNFAIP 3 in c. HL detectedby interphasecytogenetics. FICTION analyses of. representative c. HL cases combining. CD 30 expression(red) and FISH probes for TNFAIP 3 and chromosome 6 centromere (blue [b]). In the double-color assays in A–C and E and F, the TNFAIP 3 probe is labeled in green (g); in the triple-color assay applied in D, the TNFAIP 3 probe gives a g/orange colocalized (co) signal. Two different strategies are used to display double- and triple-color FISH assays in combination with CD 30 immunofluorescence; i. e. , double-color assays (A–C and E and F) are shown using a triple-color display, whereas a false multicolor display as obtained by Isis software is applied for the triple-color assay (D) to simultaneously show four colors (i. e. , CD 30 [r], TNFAIP 3 [g] and orange, and chromosome 6 centromere [b]).

Цифровая запись микроизображений открыла возможность переведения в псевдоцвета не только комбинации флуорофоров но и соотношения их, интенсивностей

Многоцветное окрашивание хромосом (Muli. Color Banding – МСВ) Данный метод предназначен не для полного анализа всех хромосом, а для проведения детального анализа отдельной хромосомы. Локус-специфичные ДНК-зонды метят различными флуорофорами или комбинациями флуорофоров так, что уровень сигнала каждого из ДНК-зондов варьирует по интенсивности. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК-зондов обеспечивает вариации соотношений интенсивностей флуоресценций различных флуорофоров вдоль хромосомы. Отношения интенсивностей могут быть переведены в псевдоцвета, и, таким образом, каждой точке изображения, а, следовательно, каждому из хромосомных локусов, будет соответствовать свой псевдоцвет. Данный вариант многоцветного FISH-метода оказался высокоэффективным при анализе не только межхромосомных, но и внутрихромосомных перестроек при онкологических заболеваниях. Однакодля его успешного применения необходимо предварительно определить хромосому, которая будет исследована. Данный метод молекулярной цитогенетики подходит для анализа нарушений кариотипа, ассоциированных с определенными хромосомами.

К настоящему времени созданы наборы ДНК-зондов, обеспечивающ проведение МСВ для всех хромосом человека Многоцветный бэндингпятой хромосомы человека (иллюстрация Meta. Systems Gmb. H) (in situ гибридизация район-специфичных ДНК-библиотек хромосомы 5; профили сигналов район-специфичных ДНК-библиотек на хромосоме 5; многоцветный бэндинг хромосомы 5; идиограмма хромосомы 5; флуорохромы, использованные для МСВ).

Метафазная цитогенетика, исторически возникшая раньше интерфазной, позволяет определять широкий спектр хромосомных нарушений, но для этого необходимо, чтобы исследуемые клетки находились на стадии метафазы мейоза.

Многоцветное кариотипирование Анализ осуществляется при использовании ДНК зондов сплошного окрашивания к плечам или целым хромосомам (зонды WCP - whole chromosome paint). Такие зонды гибридизуются с многочисленными короткими последовательностями ДНК, расположенными по всей длине хромосомы. Таким образом, при изучении под флуоресцентным микроскопом хромосома выглядит равномерно окрашенной в определенный цвет.

ДНК - зонды, используемые для такого анализа, состоят из смеси зондов сплошного окрашивания для полного набора хромосом человека, помеченных с помощью комбинации из нескольких флуорохромов, соотношение которых подобрано индивидуально для каждой пары хромосом. Использование соответствующих методов регистрации и компьютерных программ анализа изображения, оценивающих интенсивность свечения всех флуорохромов для каждой точки изображения, позволяет провести кариотипирование, при котором каждая пара хромосом имеет свой уникальный "псевдоцвет".

M-FISH (multitarget multifluor multicolorили multiplex. FISH) , является общим названием для традиционных многоцветных FISH, использующих комплекты флуорохром-специфичных фильтров. Принцип M-FISHзаключается в раздельной цифровой регистрации сигнала всех используемых флуорохромов, что достигается последовательной сменой комплектов фильтров. Все изображения записываются в отдельные файлы, что позволяет проводить их эффективную обработку, связанную с разделением сигнала и фона, а также количественной оценкой сигнала. Обработка всей записанной информации с помощью специального программного обеспечения переводит информацию об уровне сигналов флуорохромов в каждой точке изображения в псевдоцвета. Одним из основных ограничений числа используемых ДНК-зондов является число доступных флуорохромов, с неперекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, и наличие соответствующих комплектов фильтров.

24 -цветная FISH Наиболее широко M-FISH используется как 24 -цветная FISH для одновременной идентификации материала всех хромосом человека. Она обладает высокой эффективностью при детекции хромосомных транслокаций, но не предназначена для выявления делеций и инверсий. Однако, эта проблема может быть частично решена одновременной окраской хромосом DAPI, что дает возможность проведения анализа дифференциальной исчерченности хромосом, хромосомная принадлежность материала которых уже идентифицирована. К сожалению, необходимо заметить, что качество DAPI-бэндинга хромосом после M-FISH существенно уступает GTGдифференциальной окраске и даже DAPI-бэндингу после обычной in situ гибридизации.

Rx. FISH Принцип M-FISH был использован для создания многоцвет бар кода хромосом человека и метода многоцветного бэндингахромосом, основанного на межвидовой in situ гибридизации. В отличие от 24 цветной FISH этот метод позволяет непосредственно выявлять часть внутрихромосомных перестроек. ДНК зонды используемые в Rх. FISH, помечены комбинацией, 3 -х флуорохромов, что обеспечивает 7 псевдоцветов. Они специфично окрашивают отдельные районы хромосом, создавая их цветную исчерченность. Такая особенность ДНК проб для Rх. FISH обусловлена способом их получения. Они представляют собой хромосом специфичные ДНК библиотеки двух видов гиббонов: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus.

В результате интенсивных хромосомных перестроек, имевших место при формировании современных видов гиббонов, материал их хромосом оказался сильно перетасованным в сравнении с организацией хромосом у человека, хромосомы которого известны своим консерватизмом. Отношение хромосомы 1 человека к хромосомам гиббонов приведен рисунке 1,

на рисунке 2 приведен общий вид хромосом человека полученный в результате Rх. FISH. а) Метафазная пластинка б) Раскладка хромосом.

Однако RXFISH имеет достаточно серьезные ограничени - перестройки хромосом, имевшие место внутри одного цветного RX-бэнда не могут быть выявлены с помощью этого метода, если они не приводят к значительным и легко видимым изменениям размера этого бэнда. - зонды окрашивают несколько хромосомных районов разных хромосом в один псевдоцвет. Тем не менее, при увеличении числа используемых флуорохромов несомненно, метод RXFISH, будет более информативным, чем рутинная 24 -цветная FISH.

К достоинствам RXFISH в настоящее время следует отнести следующие пункты: Метод позволяет осуществлять анализ всего генома человека в одном эксперименте многоцветной FISH. Имеются в наличии коммерчески доступные наборы меченых ДНК проб и необходимых систем детекции. Метод позволяет проводить быструю идентификацию значительной части внутри - и межхромосомных перестроек. Возможна автоматическая идентификация метафазных хромосом “цветного бэндинга”. Для каждой хромосомы человека существует уникальный цветовой бар код. RXFISH интегрирован в рабочую станцию Cyto. Vision и стандартные системы флуоресцентной микроскопии.

Спекральноекариотипирование (SKY-spectralkaryotyping) Основные принципы анализа микроскопических изображений при спектральном кариотипировании практически не отличаются от используемых при M-FISH. Отличия связаны со способом регистрации изображения. Технология SKY позволяет в ходе одного измерения получать спектральные кривые для всех точек изображения, вне зависимости связано ли это с эпифлуоресценцией или с традиционной световой микроскопией. Для спектрального кариотипирования всех хромосом человека используют пять флуорохромов один в зеленом спектре, : два в красном и два в инфракрасном. Возбуждение и эмиссия всех флуорохромов, используемых при мечении ДНК зондов, проходит при одном комплекте фильтров, что позволяет избежать их последовательной смены, промежуточных фокусировок, а, следовательно, и связанных с ними проблем, таких как пространственный сдвиг изображения, определение пороговых значений и сегментационных масок. На основании анализа спектральных кривых определяетс наличие или отсутствие в данной точке конкретных флуорохромов.

Следующим шагом является процедура классификации, которая позволяет прямо и однозначно определять хромосомную принадлежность анализируемого материала. Это обеспечивает надежную идентификацию (с точностью до хромосомы) материала маркерных хромосом, а также дериватов хромосом, являющихся следствием разнообразных перестроек. Большим достоинством SKY является то, что параллельно спектральному имиджу регистрируется окраска DAPI. Программное улучшение DAPI бэндинга позволяет достичь дифференциальной исчерченности по качеству близкой к GTG-бэндингу. Возможность параллельного анализа спектрального имиджа и качественной дифференциальной окраски хромосом значительно упрощает интерпретацию результатов SKY и позволяет более точно определять точки хромосомных разрывов. К несомненным достоинствам SKY относится возможность использования флуорохромов с перекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, что значительно расширяет список пригодных к использованию флуорохромов, а также увеличивает число, флуорохромов, которые могут быть использованы одновременно. Включение в список нового флуорохрома не требует приобретения нового комплекта фильтров, так как для проведения SKY достаточно одного блока фильтров для спектральной FISH и одного блока фильтров для DAPI.

К недостаткам SKY можно отнести: - длительное время экспонирования, необходим для записи микроскопических изображений. - SKY является несколько менее эффективным чем М-FISH, в случае необходимости проведения исследований с относительно небольшими по разме ДНК-зондами.

Кариотипирование переменой цвета (ССКс Color changing karyotyping) Этот метод основан на анализе различия в длине сигнала между образцами ДНК, гибридизованными с ДНК - зондами, связанными с флуорохромами, и с ДНК - зондами, несущими антитела. Метод осуществим при наличии всего 3 фильтров и не требует специальных камер и программного обеспечения. Для идентификации хромосом проводят одну гибридизацию и получают два изображения. В основе метода лежит различие в длине флуоресцентного сигнала, поскольку время экспозиции проб ДНК, связанных с антителами, на 80 - 90% меньше, чем проб, связанных с флуорохромами. После реакции гибридизации мазки экспонируют с соответствующими первичными антителами, а затем проводят визуализацию, получая первый снимок. Затем препараты экспонируют с вторичными антителами и авидином, связанными с теми же флуорохромами. Мазки можно контрокрасить, используя DAPI.

В дальнейшем снова получают снимки препаратов, используя поочередно 3 фильтра. Эти изображения сопоставляют, используя специальное программное обеспечение, и получают второй снимок, на котором будут видны только хромосомы, связанные с определенными антителами. Таким образом, некоторые хромосомы будут флуоресцировать только на первом или втором снимке, в то время как другие будут изменять свой цвет на разных снимках.

Сравнительная геномная гибридизация (CGH) Метод был создан для выявления количественных нарушений в геноме. Он основан на проведении реакции гибридизации in situ с использованием в качестве ДНК - зонда всего генома. Выделенную и нормальную донорскую ДНК метят флуорохромами разного цвета, превращая их таким образом в ДНК зонды. Эквивалентные количества этих зондов смешивают и используют при гибридизации с контрольным цитогенетическим препаратом. После проведения FISH метафазы анализируют на флуоресцентном микроскопе, определяя с помощью специализированной программы компьютерного анализа изображения интенсивность флуоресценции двух флуорохромов по всей длине каждой хромосомы.

При отсутствии количественных изменений в кариотипе исследуемого образца будет наблюдаться определенное соотношение интенсивности свечения двух флуорохромов. В случае амплификации генов интенсивность сигнала соответствующего флуорохрома будет усиливаться, а в случае потери части генетического материала, наоборот, - ослабевать. Таким образом, CGH позволяет выявить геномный дисбаланс, но этот метод нельзя использовать для обнаружения сбалансированных транслокаций и инверсий, а трисомии и делеции можно определить только в том случае, если размер несбалансированного участка составляет не менее 10 млн. пар нуклеотидов.

Хромосомный дисбаланс в исследуемом образце оценивают по разнице в интенсивности флуоресценции двух разных флуорохромов с помощью вычисления флуоресцентного отношения (ФО).

Метод CGH имеет ряд достоинств по сравнению с другими методами анализа изменений генома: Во-первых, он не зависит от источника исследуемого материала, и может быть успешно проведен с малым количеством тестируемой ДНК, включая архивный материал. Во-вторых, он позволяет получить детальную информацию о потерях или увеличении числа копий генетического материала по всему геному в одном эксперименте. В третьих, метод CGH не требует приготовления препаратов метафазных хромосом из исследуемой ткани, то есть не зависит от процесса культивирования клеток и связанных с ним артефактов.

Геномная гибридизация situ (genomicin situ hybridization in , GISH) – вариант метода гибридизации situ, заключающийся в in том, что для гибридизации с фиксированными образцам качестве флуоресцентно меченного зонда используется суммарная геномная ДНК одного вида организма, с которой конкурирует суммарная геномная ДНК другог вида организма; используется для определения межвидовых и внутривидовых различий геномов, хромосомных перестроек, делецийи замещений.

Вариации FISH 1) Q-FISH – quantitative FISH: Разработан Lansdorp et al: U. M. Martens, J. M. Zijlmans, S. S. Poon, W. Dragowska, J. Yui, E. A. Chavez, R. K. Ward, and P. M. Lansdorp. 1998. Short telomeres on human chromosome 17 p. Nat. Genet. 18: 76 -80. Количественный метод. Разработан для работы с проточной цитометрией. Изначально применялся для измерения длины хромосом (разрешение: 200 bp) путем подсчета числа теломерных повторов. Используются PNA-конъюгированные зонды. Изначально исследовали метафазные хромосомы (собственно QFISH), теперь данный метод применим и для интерфазных хромосом (IQ-FISH). Q-FISH проводится на культуре клеток, срезах тканей (оба на стеклах). На данный момент Q-FISH является важным инструментом в изучении роли теломеров в процессах старения и ракообразования.

PNA-FISH – Peptide nucleic acids FISH: Пептидные нуклеиновые кислоты (PNAs) – синтетические аналоги ДНК, в котором сахарный остов фосфата дезоксирибозы, поддерживающий азотистое основание, заменен на незаряженный пептидный остов. В результате такой структуры: при гибридизации PNA-олигомерного зонда с комплементарной ДНК/ РНК не происходит электростатического отталкивания. PNA-DNA (PNA-RNA) дуплексы гораздо стабильнее натуральных гомо/гетеродуплексов. Высокая специфичность связывания PNA-DNA: PNA-DNA гибридизация намного чувствительнее в отношении несоответствия пар оснований, чем DNA-DNA гибридизация. Так, с помощью PNA-зонда можно различить два центромерных повтора, различающиеся всего по одной паре оснований. PNA обладает относительной гидрофобностью (по сравнению с DNA), вследствие чего PNA лучше диффундирует сквозь клеточные стенки => широкое применение в микробиологии. На основании высокой специфичности связывания: считается, что PNA технология в скором времени станет основой для создания аллель-специфичных зондов для in situ гибридизации. Применяется в генетике, цитогенетике, эпигенетике, микробиологии и др.

3) Flow-FISH – FISH for flow cytometry: Предложен в 1998 г. : Rufer, N. , Dragowska, W. , Thornbury, G. , Roosnek, E. & Lansdorp, P. M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nature Biotechnol. 16, 743– 747 (1998). Комбинация Q-FISH и проточной цитометрии, позволяющая анализировать (измерять) сигнал и сортировать. Для flow-FISH используется клеточная суспензия (для измерение длины теломеров хромосом), хромосомные спреды и выделенные хромосомы (для дальнейшего картирования). Как и в Q-FISH, используются PNA-меченые теломерные зонды (например, для визуализации и измерения длины теломерных повторов) Главное преимущество – более быстрый метод (анализ/сортировка большого количества клеток/хромосом). Широко применяется для исследования разных проблем: старения, сохранение теломер, исследование суспензий гемотопоетических стволовых клеток ex vivo, исследование бактерий.

Multiparametric analysis allows for differentiation of cell types within one sample, allowing for internal control, and analysis of leukocyte subtypes.

Преимущества flow-FISH: Легко воспроизводимый результат Возможность анализировать подгруппы клеток в популяции используя физические иммунофлюоресцентные и маркеры Лучшая производительность, чем в Q-FISH Возможность получать количественные данные по флюоресценции тысяч клеток.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ХРОМОСОМ с помощью методов проточной цитометрии 1. Сортировка хромосом с помощью проточной цитометрии - Кариотипирование с помощью проточной цитометрии используется для дальнейшего картирования генов и построения хромосомных библиотек. - Идентификация и локализация генов на сортированных хромосомах производится с последующим применением методов FISH/ метода PRINS (primed in situ labeling) или его вариаций и хромосом-специфической ПЦР. - К 2011 г. успешно сортированы пока только хромосомы 17 видов культивированных растений. - Сортировка метафазных или пахитенных хромосом с высоким индексом деления.

Флуоресцентная метка: - Хромосомы метятся флуорохромами, специфичными к нуклеиновым кислотам. - Флюорохромы выбираются в соответствии 1) со специфичностью к азотистыми основаниями, 2) с условиями эксперимента (в том числе учитывая длины волн имеющихся лазеров). 1. Для моновариантного анализа используют краски, не специфичные к A-T или G-C парам: propidium iodide(пик возбуждения: 535 нм, эмиссии: 617 нм, требуемый лазер: 488 нм-аргоновый лазер или лампа + long-pass filter) ethidiumbromide (пики возбуждения: 300 и 520 нм, эмиссии: 600 нм, требуемый лазер: 488 нм-аргоновый лазер или лампа + long-pass filter) Данные метки красят ДНК не зависимо от содержания A, G, T или Cазотистых оснований. 2. Для бивариантного анализа используют: chromomycin (специфичен для G-C пар оснований), пик A 3 возбуждения: 458 нм, эмиссии 580 нм. Лазер: , 458 нм минимум 400 м. В мощность. Hoechst 33258(специфичен для A-T пар оснований), возбуждение: 351 -364 нм, эмиссия: 470 нм. Лазер: 351 -364 нм (мощный). Лазеры должны быть разделены во времени и пространстве из-за частичного перекрытия спектров флюорохромов.

2. Исследование хромосом/ нуклеотидных последовательностей после сортировки (для построения физических и генетических карт и т. п.) FISH BAC-FISH PRINS C-PRINS Исследование больших геномов с длинными хромосомами. Картирование последовательностей с большим количеством повторов (пр: теломерных и центромерных участков). Использование коротких зондов. Благодаря большому количеству повторов сигнал сильный. Стандартная величина зонда: 15 – 30 нуклеотидов. FISH

Проблемы FISH: Сложно локализовать однолокусные последовательности ДНК (т. е. неповторяющиеся уникальные последовательности ДНК), т. к. при использовании стандартных коротких зондов сигнал будет очень слабым. Увеличение длины зонда до нескольких килобаз для усиления сигнала приведет к снижению чувствительности и => к неспецифическому связыванию. Решение: BAC-FISH -BAC-FISH – комбинация метода FISH и использования клонов геномной ДНК, встроенной в бактериальные искусственные хромосомы (BAC), позволяющие встраивать большие последовательности ДНК. -Эффективный метод для идентификации и картирования отдельных хромосом организмов с небольшими геномами. В качестве зонда используется BAC-зонды, overgos (overlapping oligonucleotides).

Альтернатива FISH: PRINS PRINS (primed in situ labeling) – способ мечения хромосом с помощью отжига олигонуклеотидного ДНК-праймера с гомологичной последовательностью денатурированной хромосомной ДНК и последующего энзиматического удлинения праймера in situ мечеными нуклеотидами. Впервые описан Koch et al. в 1989 г. (Koch, J. E. , Kølvraa, S. , Petersen, K. B. , Gregersen, N. , and Bolund, I. (1989) Oligonucleotide-priming methods for the chromosome-specific labelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma 98, 259– 265). PRINS является альтернативой FISH. Применяется для локализации нуклеотидных последовательностей, распознавания и подсчета метафазных или интерфазных хромосом или хромосомных пар (в т. ч. хромосомной анеуплоидии). отжиг немеченого праймера (праймер – затравка) с исследуемой ДНК элонгация затравки с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и меченых нуклеотидов остановка реакции (присоединение блокирующей молекулы на 3’ -конец) Праймер: фрагмент рестрикции ПЦР-продукт олигонуклеотид Мечение нуклеотидов: - прямое (флюорохромами) - непрямое (biotin/ dig флюорохромконъюгированный avidin/ anti-dig) - В результаты каждой PRINS реакции можно идентифицировать только одну пару гомологичных хромосом (одну хромосому). Следующую реакцию PRINS на том же стекле можно проводить только после блокировки предыдущей. - Применяется для последовательностей ДНК с большим количеством повтором.

Преимущества PRINS: 1. Требуется минимальная информация о последовательности, необходимая для синтеза олигонуклеотидного праймера. 2. Наиболее быстрый и простой метод детекции интересующей нас последовательности на хромосоме (по сравнению с использованием тяжелых зондов для FISH, гибридизующихся очень большой промежуток времени). 3. Исключение стадии мечения зонда. 4. Возможность элонгировать праймер мечеными нуклеотидами для усиления c-PRINS сигнала при детекции коротких уникальных последовательностей. Для выявления малокопийных повторов или коротких уникальных последовательностей применяется более чувствительный метод – cycling PRINS (c -PRINS). C-PRINS предложен Gosden et al. в 1991 г. , улучшенный широко используемый протокол – Kubaláková et al. , 2001 (Kubaláková M, Vrána J, Cíhalíková J, Lysák MA, Dole J (2001). Localisation of DNA sequences on plant chromosomes using PRINS and C-PRINS. Methods in Cell Science 23: 71 -82). C-PRINS включает в себя серию термальных циклов, аналогичных ПЦР.

Sheath fluid for FISH: -BD Bioscience Standard (GM Baerlocher, I Vulto, G de Jong, PM Lansdorp. Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH). 2006. Nature Protocols 1, - 2365 – 2376) -40 m. M KCl + 10 m. M Na. Cl (Vrána J, Kubaláková M, Simková H, Cíhalíková J, Lysák MA, Dolezel J. Flow sorting of mitotic chromosomes in common wheat (Triticum aestivum L.). Genetics. 2000; 156(4): 2033 -41) -Mg. So 4 buffer without dithiothreitol (Lj. Li, L. Ma, K. Arumuganathan, Y. C. Song. Flow-sorted chromosomes: a fine material for plant gene physical mapping. Caryologia. 2006, vol. 59, № 2: 99 -103) -autoclaved 0. 1% (wt/vol) Na. Cl -50 m. M Na. Cl (M Kubaláková, P Kovářová, P Suchánková, J Číhalíková, J Bartoš, S Lucretti, N Watanabe, SF Kianian, J Doležel. Chromosome Sorting in Tetraploid Wheat and Its Potential for Genome Analysis. Genetics. 2005, 170(2): 823– 829) -Chromosome-stabilizing polyamine buffer (protein-containing sheath fluid) (Darzynkiewics Z, Robinson JP, Crissman H. Flow Cytometry, 2 nd Ed. Part B. San Diego, CA. Academic Press, Inc. 1994)

Лекция 4.

Гибридизация хромосом

Введение

Для выяснения локализации отдельных генов на хромосомах (то есть картирования генов) используют целый арсенал специальных методов. Один из основных – молекулярная гибридизация (образование гибрида) гена или его фрагмента с фиксированными на твердой подложке препаратами хромосом, выделенными из клеток в чистом виде (это называют гибридизацией in situ). Суть метода гибридизации in situ заключается во взаимодействии (гибридизации) между денатурированными (расплетенными) нитями ДНК в хромосомах и комплементарными нуклеотидными последовательностями, добавленных к препарату хромосом однонитевых ДНК или РНК (их называют зондами).

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH)

Данный метод позволил перейти от изучения морфологии хромосом к анализу последовательностей ДНК, входящих в их состав.В методе FISH используются флуоресцирующие молекулы для прижизненной окраски генов или хромосом. Метод используется для картирования генов и идентификации хромосомных аберраций.

Методика начинается с приготовления коротких последовательностей ДНК, называемых зондами, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК, представляющим объект изучения. Зонды гибридизуются (связываются) с комплементарными участками ДНК и благодаря тому, что они помечены флуоресцентной меткой, позволяют видеть локализацию интересующих генов в составе ДНК или хромосом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается гибкость метода.

FISH может применяться для различных целей с использованием зондов трех различных типов:

локус-специфичные зонды , связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом;
альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа;
зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно "раскрасить" всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия опухоли, плацента, эмбриональные ткани или амниотическая жидкость. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные препараты клеток. Меченные флуоресцентными метками специфические ДНК-зонды гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным и чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно выявлять рад транслокаций, связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Метод также может использоваться для мониторинга остаточных явлений онкозаболевания после химиотерапии и пересадки костного мозга и выявления усиленных онкогенов, связанных с неблагоприятным прогнозом в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга, полученного от индивида противоположного пола. FISH также применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.

Таким образом, общий вид протокола для постановки FISH можно представить в следующем виде:

1) Подготовка гистологического или цитологического препарата

Подготовка гистологического препарата осуществляется по стандартной схеме: вырезка, маркировка, проводка, заливка, микротомия, помещение среза на предметное стекло и депарафинизация. При подготовке цитологического препарата используются специальные осаждающие растворы и центрифугирование, что позволяет получить концентрированную суспензию клеток.

2) Предварительная обработка (если необходимо)

Препарат обрабатывается протеазами, чтобы исключить присутствие белков, которые затрудняют гибридизацию.

3) Нанесение ДНК-зонда на препарат и последующая денатурация

Для того чтобы денатурировать зонд и ДНК образца, их обрабатывают формамидом и нагревают до температуры около 85–90ºС.

4) Гибридизация

После денатурации препарат охлаждают до определенной температуры (37ºС в случае клинических исследований) и инкубируют во влажной камере в течение нескольких часов (продолжительность инкубации указана в каждом конкретном протоколе). В настоящее время для денатурации и гибридизации используют автоматические гибридайзеры.

5) Промывка.

После того, как гибридизация завершена, необходимо отмыть несвязавшиеся зонды, которые, в противном случае, создадут фон, затрудняющий оценку результатов FISH-анализа. Для промывки обычно используют раствор, содержащий цитрат и хлорид натрия (SSC).

6) Контрокрашивание

При помощи флуоресцентных красителей (DAPI - 4,6-диамидин-2-фенилиндол; йодид пропидия) проводится окраска всей ядерной ДНК.

7) Анализ результатов при помощи флуоресцентного микроскопа

Особенно важным для изучения генома человека на первых этапах его исследования стал метод, называемый гибридизацией соматических клеток. При смешивании соматических (неполовых) клеток человека с клетками других видов животных (чаще всего для этой цели использовали клетки мышей или китайских хомячков) в присутствии определенных агентов может происходить слияние их ядер (гибридизация). При размножении таких гибридных клеток происходят потери некоторых хромосом. По счастливой для экспериментаторов случайности в гибридных клетках человек–мышь происходит потеря большей части хромосом человека. Далее отбираются гибриды, в которых остается только какая–нибудь одна человеческая хромосома. Исследования таких гибридов позволили связать некоторые биохимические признаки, свойственные клеткам человека, с определенными хромосомами человека. Постепенно благодаря использованию селективных сред научились добиваться сохранения или потери отдельных хромосом человека, несущих определенные гены.

Для того чтобы облегчить слияние клеток разных видов, в культуральную среду добавляют вирус Сендай, инактивированный ультрафиолетовым облучением, или полиэтиленгликоль. Для отбора слившихся клеток от исходных клеток человека и мыши клетки выращивают на специальной селективной среде, которая позволяет размножаться только гибридным клеткам.

На сегодняшний день хромогенная гибридизация in situ является более доступным методом, чем флуоресцентная. Если речь идет о флуоресцентной гибридизации in situ, то ДНК-зонд коньюгирован с флуоресцентной меткой. Результаты такого исследования оценивают во флуоресцентном микроскопе. В случае хромогенной гибридизации in situ, ДНК-зонд коньюгируют с пероксидазой или чем-либо другим и проводят окрашивание хромогеном. В этом случае результаты оценивают под обычным световым микроскопом.

ü Преимущества FISH-метода

В качестве основных преимуществ FISH можно выделить следующие:

1) возможность исследования генетического материала в интерфазных ядрах;

2) получение объективных результатов по принципу «да/нет» - это количественный метод;

3) относительно простая интерпретация результатов;

4) высокая разрешающая способность.

ü Недостатки FISH-метода

1) флуоресцентные красители быстро «выцветают»;

2) для анализа результатов необходим высококачественный флуоресцентный микроскоп.

В некоторых случаях цитогенетического исследования бывает недостаточно для выдачи заключения о кариотипе, в этих случаях используют молекулярно-цитогенетические методы в частности флуоресцентную гибридизацию in situ (англ. - Fluorescence In Situ Hybridization - FISH) .

Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, базирующихся преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики. Метод in situ гибридизации был разработан для локализации конкретных последовательностей ДНК непосредственно на цитологических препаратах. Произошел переход в идентификации хромосом и хромосомных районов с анализа цитологической организации хромосомы на анализ последовательностей ДНК, входящих в их состав. Сравнение эффективности классических цитологических методов выявления и анализа хромосомных перестроек, таких как дифференциальные окраски хромосом, с современными молекулярно-цитогенетическими технологиями показало, что при гематологических нарушениях цитологический анализ хромосом детектирует и правильно идентифицирует лишь около трети хромосомных перестроек, выявляемых при использовании спектрального кариотипирования (SKY). Еще около трети перестроек идентифицируются цитологическими методами неверно, а треть остается совсем незамеченной. Классические методы цитогенетического анализа позволяют выявлять лишь около 15 % хромосомных перестроек, идентифицируемых с помощью SKY.

В методе FISH используются флуоресцирующие молекулы для прижизненной окраски генов или хромосом. Метод используется для картирования генов и идентификации хромосомных аберраций.

FISH может применяться для различных целей с использованием зондов трех различных типов:

* локус-специфичные зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом. Данные зонды используются для идентификации имеющейся короткой последовательности выделенной ДНК, которая используется для приготовления меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом;
* альфоидные или центромерные зонды-повторы представляют собой повторяющиеся последовательности центромерных областей хромосом. С их помощью каждая хромосома может быть окрашена в различный цвет, что позволяет быстро определить число хромосом и отклонения от нормального их числа;
* зонды на всю хромосому являются набором небольших зондов, комплементарных к отдельным участкам хромосомы, но в целом покрывающими всю ее длину. Используя библиотеку таких зондов можно «раскрасить» всю хромосому и получить дифференциальный спектральный кариотип индивида. Данный тип анализа применяется для анализа хромосомных аберраций, например транслокаций, когда кусочек одной хромосомы переносится на плечо другой.

Гибридизация in situ с флуоресцентной меткой (FISH)

Материалом для исследования является кровь, костный мозг, биопсия опухоли, плацента, эмбриональные ткани или амниотическая жидкость. Образцы для исследования должны доставляться в лабораторию в свежем виде. Препараты (слайды) готовятся непосредственно из образцов ткани или после их культивирования. Могут использоваться как метафазные, так и интерфазные препараты клеток. Меченные флуоресцентными метками специфические ДНК-зонды гибридизуюся с хромосомной ДНК, причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам.

FISH является полезным и чувствительным методом цитогенетического анализа при выявлении количественных и качественных хромосомных аберраций, таких как делеции (в том числе и микроделеции), транслокации, удвоение и анэуплоидия. FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом. В онкологии с помощью FISH можно выявлять рад транслокаций (bcr/abl, MLL, PML/RARA, TEL/AML1), связанных с гематологическими злокачественными новообразованиями. Метод также может использоваться для мониторинга остаточных явлений онкозаболевания после химиотерапии и пересадки костного мозга и выявления усиленных онкогенов (c-myc/n-myc), связанных с неблагоприятным прогнозом в отношении некоторых опухолей. FISH также используется для контроля приживаемости аллотрансплантата костного мозга, полученного от индивида противоположного пола.

FISH является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций и одномоментного быстрого анализа большого (> 500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью при идентификации природы хромосом и неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.